比较胰酶/EDTA两种消化液对携带水痘-带疱疹病毒的2BS消化效果分析
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【摘要】 目的 比较胰酶和EDTA两种消化液消化感染水痘-带状疱疹病毒的2BS细胞冻融后的病毒滴度(VT)。方法 分别配制两种浓度的胰酶和EDTA：0.125%、0.25%的胰酶，0.01%、0.02%的EDTA各1000 ml，按比例加入预先培养好的携带水痘-带疱疹病毒的等量2BS细胞中，消化后，用显微镜观察细胞形态，消化液离心、浓缩、冻融、检测并比较病毒滴度。结果 与0.125%、0.25%的胰酶、0.01%EDTA， 0.25%的胰酶与0.02%的EDTA混合消化液相比，用0.02%的EDTA消化液消化感染水痘-带状疱疹病毒的2BS细胞，冻融后的病毒滴度提高了1.3～0.8个log值。结论 用0.2%EDTA消化液消化的含有水痘病毒的细胞获得的病毒滴度最好。
【关键词】 胰酶;EDTA; 2BS 细胞;病毒滴度
【Abstract】 Objective The analysis of the healing effect two digestive trypsin and EDTA digestion and chickenpox-herpes zoster virus 2BS cells after freezing and thawing of the virus titer(VT). Methods The preparation of two concentrations of trypsin and EDTA: 0.125%, 0.25% trypsin, 0.01%, 0.02% EDTA all 1000 ml, added in proportion to carry a good pre-training varicella-zoster virus with the equivalent 2BS cells, digestion, cell morphology was observed with a microscope, centrifuge digestion, concentration, freeze-thaw, test and compare the virus titers.Results And 0.125%, 0.25% trypsin, 0.01% EDTA, 0.25% trypsin and 0.02% EDTA mixture of digestive juice, compared with 0.02% EDTA digestion digestive infection of varicella-zoster virus 2BS cells, the virus titer after freezing and thawing increased 1.3～0.8 a log value.Conclusion Digestion with 0.2% EDTA digestion of cells containing varicella virus titer obtained by the best.
【Key words】 Trypsin, EDTA; 2BS cells; Virus titers
水痘疫苗作为预防水痘-带状疱疹病毒的唯一有效制剂已问世多年，主要用2BS细胞培养病毒并制备疫苗，疫苗的制备工艺也以2BS细胞的转瓶培养代替其细胞的静止培养[1]，生产工艺中细胞消化是工艺必不可少的步骤，直接影响疫苗的质量，是生产工艺的关键点，以往没有文献报道，细胞消化一般采用胰酶和EDTA[2]，本研究主要以不同浓度的胰酶和EDTA消化细胞，冻融后通过细胞形态和病毒滴度检测，对疫苗的质量进行比较，该研究为生产高质量疫苗提供试验依据。两者虽然都是从培养皿上消化细胞，但取得的结果不同。作者主要是总结比较，通过不同消化液的消化方式，哪种方式获得的细胞利于冻融，不影响细胞内病毒存活，生产时获得高滴度疫苗。
1 材料与方法
1.1 材料及仪器设备 2BS细胞(人胚肺二倍体细胞由国家药品当局批准的二倍体细胞2BS)
1.2 胰酶(trypsin美国Becton,Dickinson and company)
1.3 EDTA(Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt国药集团化学试剂有限公司)
1.4 显微镜(型号XDS-1B厂家：重庆光学仪器厂)
1.5 转瓶机(型号GD/T76厂家：长城仪器设备厂)
1.6 细胞培养液：细胞培养液为含10%灭活小牛血清的Eagle'sMEM液，PH为7.2～7.3。
2 方法
2.1 配制0.125%、0.25%的胰酶细胞消化液 分别称取胰酶粉末1.25 g、2.5 g,先用少许灭菌过的PBS调成糊状，分别定容至1000 ml，室温搅拌至溶解，除菌过滤，分装，4℃保存备用。
2.2 配制0.01%、EDTA细胞消化液 秤取EDTA 0.1 g、Nacl 4.45 g,KCl 0.1 g,NaHPO4﹒12 h2O 1.45 g,KH2PO4 0.1 g,先用少许灭菌注射用水溶解，然后定容至1000 ml.
2.3 配制0.02%、EDTA细胞消化液 秤取EDTA 0.2 g、Nacl 8.9 g,KCl 0.2 g,NaHPO4﹒12 h2O 2.9 g,KH2PO4 0.2 g,先用少许灭菌注射用水溶解，然后定容至1000 ml.
2.4 制备2BS细胞 将长成单层的2BS细胞进行细胞计数，取等量的细胞传代接种于转瓶中，转瓶机置30 r/h，转瓶37℃培养成致密单层，该试验制备了25瓶细胞。
2.5 感染水痘-带状疱疹病毒 长成单层的2 BS细胞按一定比例加入水痘-带状疱疹病毒毒种感染细胞,35℃～36℃培养至细胞病变达75%以上。
2.6 消化感染病毒细胞 将病变细胞用生理盐水冲洗细胞面,洗去牛血清,分别用不同浓度的等量的胰酶及EDTA液消化感染细胞。
2.7 镜检及病毒滴度检测 抽取不同消化液消化后的感染细胞计数并显微镜下观察细胞形态，取不同消化液消化的感染细胞用用蚀斑法[3](PFU)在2 BS株进行病毒滴度测定 ......
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