RP—HPLC—PDA同时测定石见穿不同部位中5个三萜酸(1)
[摘要]目的：建立RP-HPLC-PDA测定石见穿不同部位中5个三萜酸(坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸)的定量方法。方法：采用Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(90∶10，体积比)，等度洗脱，检测波长205 nm，流速0.8 mL·min-1，柱温28 ℃。结果：坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸线性范围分别为0.096 00～2.400，0.123 0～3.075，0.242 0～6.050，0.283 0～7.075和0.273 0～6.825 μg(r=0.999 8，0.999 7，0.999 9，0.999 5，0.999 9)，平均加样回收率(n=6)分别为98.43%，98.13%，100.6%，98.19%，99.15%(RSD 1.3%，0.67%，1.2%，0.87%，0.43%)。结论：该方法操作简便，重复性好，可用于石见穿中主要三萜酸的定量分析。
[关键词]RP-HPLC；石见穿；三萜酸；坡模酸；山楂酸；科罗索酸；齐墩果酸；熊果酸；光电二极管阵列检测器
, http://www.100md.com
石见穿为唇形科植物紫参Salvia chinensis Benth.的全草，又名华鼠尾草、石打穿、紫丹花、半枝莲、月下红等，一年生草本，主产于江苏、安徽、江西、湖北、湖南、广东、广西、四川、云南等地，其性凉，味微苦、辛、平，归胃、肝、肺经[1-2]，有活血化瘀、清热利湿、散结消肿等功效，民间主治肝炎、噎嗝、痰喘、痈肿、瘰疬、赤白带等症[3]。石见穿主要含多糖类、多酚类、三萜(酸)类、甾醇类等化学成分，体内外实验表明，其提取物具有明显的抗肿瘤、抗诱变、抗促癌等作用，临床广泛应用于治疗肝炎、癌症和妇科等疾病，疗效独特[4-7]。目前，石见穿的相关研究主要集中于化学成分的提取分离、鉴别和活性研究[2，8-11]，其主要三萜酸类成分含量的同时测定方法鲜见文献报道。本文采用超声辅助提取，建立了RP-HPLC-PDA同时测定了石见穿不同部位中5个三萜酸(坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸)的含量，可为石见穿中三萜酸类药用成分的定量分析及其开发利用提供依据。
, 百拇医药 1材料
Waters515系列高效液相色谱仪(美国Waters公司)，配有2996光电二极管阵列检测器(PDA)，二元高压泵，柱温箱，Empower色谱工作站；SK2510HP超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司，功率250 W，频率59 kHz)；DJ-04药材粉碎机(上海淀久中药机械制造有限公司)；CP225D电子分析天平(德国Sartourius公司)；RO-MB-10D高纯水机(杭州永洁达膜分离设备厂)。
乙腈为色谱纯(西陇化工股份有限公司)，水为超纯水，坡模酸、山楂酸和科罗索酸对照品购于郑州利诺生物科技有限公司，齐墩果酸(批号110709-201106)和熊果酸(批号110742-201016)对照品购于中国食品药品检定研究院。石见穿(批号130301)购自湖北省，经鉴定为唇形科植物紫参S. chinensis的干燥地上部位。
2方法与结果
, 百拇医药
2.1对照品溶液的制备取坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸对照品适量，置于50 mL量瓶中，精密称定，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为坡模酸0.096 0 g·L-1，山楂酸0.123 g·L-1，科罗索酸 0.242 g·L-1，齐墩果酸0.283 g·L-1和熊果酸0.273 g·L-1的混合对照品溶液。
2.2样品溶液的制备将石见穿不同部位(叶、茎和地上部位)样品置于恒温干燥箱中，于80 ℃下干燥5 h，粉碎过筛。取粉末样品2.5 g，精密称定，分别置于50 mL具塞锥形瓶中，加入95 %乙醇50 mL，超声提取45 min，冷却后称重，用乙醇补足失重，摇匀，0.45 μm针式滤膜过滤，得样品溶液。
2.3检测波长的确定将混合对照品溶液注入液相色谱仪，应用PDA检测器在190～400 nm波段扫描，再与单组份对照品溶液相对照，提取5个三萜酸组分的紫外吸收光谱，山楂酸的最大紫外吸收波长为201.0 nm，其余组分最大紫外吸收波长均为202.2 nm，见图1，归一化处理后5个三萜酸组分的紫外吸收光谱基本一致，大于235 nm区间均无紫外吸收。为提高信噪比，保证基线平稳，消除噪音对定量分析的影响，选择205 nm为检测波长。
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2.4色谱条件色谱柱为Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈-水(90∶10)；流速0.8 mL·min-1；检测波长205 nm；柱温为28 ℃。在此色谱条件下，坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸色谱峰对称因子在0.96～1.05，与相邻色谱峰的分离度均大于1.65。对照品和样品色谱图见图2。
2.5精密度试验精密吸取坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸混合对照品溶液20 μL，连续进样5次，用积分峰面积考察色谱系统的精密度。坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸峰面积的RSD(n=5)分别为0.52%，0.70%，0.36%，0.32%，0.46%，本方法精密度良好。
2.6重复性试验取同一石见穿(叶)样品5份，每份2.5 g，精密称定，按2.2项下方法制备样品溶液，分别进样20 μL，按照2.4项下色谱条件测定峰面积积分值，外标法计算样品中坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸质量分数分别为0.243，1.50，1.43，2.45，5.81 mg·g-1，RSD(n=5)分别为 2.1%，1.0%，2.0%，1.2%，1.6%，样品制备方法重复性良好。
2.7加样回收率试验取已知5个三萜酸含量的石见穿(叶)样品6份，每份1.2 g，精密称定，分别加入与样品中5个三萜酸含量相当的对照品量，按2.2项下方法制备样品溶液，按照2.4项下色谱条件依次进样测定，计算5个对照品的平均加样回收率，结果坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸回收率分别为98.43%，98.13%，100.6%，98.19%，99.15%，RSD分别为1.3%，0.67%，1.2%，0.87%，0.43%)，结果见表1。, http://www.100md.com(姜琼 邹盛勤)
[关键词]RP-HPLC；石见穿；三萜酸；坡模酸；山楂酸；科罗索酸；齐墩果酸；熊果酸；光电二极管阵列检测器
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石见穿为唇形科植物紫参Salvia chinensis Benth.的全草，又名华鼠尾草、石打穿、紫丹花、半枝莲、月下红等，一年生草本，主产于江苏、安徽、江西、湖北、湖南、广东、广西、四川、云南等地，其性凉，味微苦、辛、平，归胃、肝、肺经[1-2]，有活血化瘀、清热利湿、散结消肿等功效，民间主治肝炎、噎嗝、痰喘、痈肿、瘰疬、赤白带等症[3]。石见穿主要含多糖类、多酚类、三萜(酸)类、甾醇类等化学成分，体内外实验表明，其提取物具有明显的抗肿瘤、抗诱变、抗促癌等作用，临床广泛应用于治疗肝炎、癌症和妇科等疾病，疗效独特[4-7]。目前，石见穿的相关研究主要集中于化学成分的提取分离、鉴别和活性研究[2，8-11]，其主要三萜酸类成分含量的同时测定方法鲜见文献报道。本文采用超声辅助提取，建立了RP-HPLC-PDA同时测定了石见穿不同部位中5个三萜酸(坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸)的含量，可为石见穿中三萜酸类药用成分的定量分析及其开发利用提供依据。
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Waters515系列高效液相色谱仪(美国Waters公司)，配有2996光电二极管阵列检测器(PDA)，二元高压泵，柱温箱，Empower色谱工作站；SK2510HP超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司，功率250 W，频率59 kHz)；DJ-04药材粉碎机(上海淀久中药机械制造有限公司)；CP225D电子分析天平(德国Sartourius公司)；RO-MB-10D高纯水机(杭州永洁达膜分离设备厂)。
乙腈为色谱纯(西陇化工股份有限公司)，水为超纯水，坡模酸、山楂酸和科罗索酸对照品购于郑州利诺生物科技有限公司，齐墩果酸(批号110709-201106)和熊果酸(批号110742-201016)对照品购于中国食品药品检定研究院。石见穿(批号130301)购自湖北省，经鉴定为唇形科植物紫参S. chinensis的干燥地上部位。
2方法与结果
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2.1对照品溶液的制备取坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸对照品适量，置于50 mL量瓶中，精密称定，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为坡模酸0.096 0 g·L-1，山楂酸0.123 g·L-1，科罗索酸 0.242 g·L-1，齐墩果酸0.283 g·L-1和熊果酸0.273 g·L-1的混合对照品溶液。
2.2样品溶液的制备将石见穿不同部位(叶、茎和地上部位)样品置于恒温干燥箱中，于80 ℃下干燥5 h，粉碎过筛。取粉末样品2.5 g，精密称定，分别置于50 mL具塞锥形瓶中，加入95 %乙醇50 mL，超声提取45 min，冷却后称重，用乙醇补足失重，摇匀，0.45 μm针式滤膜过滤，得样品溶液。
2.3检测波长的确定将混合对照品溶液注入液相色谱仪，应用PDA检测器在190～400 nm波段扫描，再与单组份对照品溶液相对照，提取5个三萜酸组分的紫外吸收光谱，山楂酸的最大紫外吸收波长为201.0 nm，其余组分最大紫外吸收波长均为202.2 nm，见图1，归一化处理后5个三萜酸组分的紫外吸收光谱基本一致，大于235 nm区间均无紫外吸收。为提高信噪比，保证基线平稳，消除噪音对定量分析的影响，选择205 nm为检测波长。
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2.4色谱条件色谱柱为Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈-水(90∶10)；流速0.8 mL·min-1；检测波长205 nm；柱温为28 ℃。在此色谱条件下，坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸色谱峰对称因子在0.96～1.05，与相邻色谱峰的分离度均大于1.65。对照品和样品色谱图见图2。
2.5精密度试验精密吸取坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸混合对照品溶液20 μL，连续进样5次，用积分峰面积考察色谱系统的精密度。坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸峰面积的RSD(n=5)分别为0.52%，0.70%，0.36%，0.32%，0.46%，本方法精密度良好。
2.6重复性试验取同一石见穿(叶)样品5份，每份2.5 g，精密称定，按2.2项下方法制备样品溶液，分别进样20 μL，按照2.4项下色谱条件测定峰面积积分值，外标法计算样品中坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸质量分数分别为0.243，1.50，1.43，2.45，5.81 mg·g-1，RSD(n=5)分别为 2.1%，1.0%，2.0%，1.2%，1.6%，样品制备方法重复性良好。
2.7加样回收率试验取已知5个三萜酸含量的石见穿(叶)样品6份，每份1.2 g，精密称定，分别加入与样品中5个三萜酸含量相当的对照品量，按2.2项下方法制备样品溶液，按照2.4项下色谱条件依次进样测定，计算5个对照品的平均加样回收率，结果坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸回收率分别为98.43%，98.13%，100.6%，98.19%，99.15%，RSD分别为1.3%，0.67%，1.2%，0.87%，0.43%)，结果见表1。, http://www.100md.com(姜琼 邹盛勤)