益母草香豆素类化学成分与抗血小板聚集活性(1)
[摘要]综合运用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20、MCI色谱以及反相C18柱色谱等方法分离纯化益母草中的化学成分，运用有机波谱学方法鉴定各化合物的结构，并进一步测试各化合物的体外抗血小板聚集活性。从益母草的乙酸乙酯部位中分离鉴定了10个香豆素类化合物，依次为佛手柑内酯(1)、花椒毒素(2)、异茴芹内酯(3)、异栓翅芹醇(4)、异欧前胡素(5)、橙皮内酯水合物(6)、异橙皮内酯(7)、九里香酮(8)、橙皮油内酯烯(9)、欧芹酚甲醚(10)。除化合物9外，其他化合物均为首次从该属植物中分离得到，活性筛选结果表明化合物4和8对ADP诱导的血小板聚集有明显的抑制作用。
[关键词]益母草；香豆素类化合物；分离鉴定；抗血小板聚集
益母草Leonurus japonicus是常用的中药材品种，原名茺蔚，别名益母艾、苦草、坤草、月母草、地母草等，传统上以开花前的地上部分入药。益母草在《神农本草经》和《本草纲目》中均被列为上品，其性微寒，味辛苦，具有调经活血、利尿消肿、祛痰生新之功效，为妇科婴药，被称为“血家圣药、经产良药”[1]。临床上主要用于月经不调，痛经经闭，恶露不尽，水肿尿少，疮疡肿毒等症[2]。目前有关益母草化学成分的报道较多，主要为生物碱[3]、二萜[4]、环烯醚萜苷[5]、黄酮[6]、三萜[7]等，但针对益母草传统功效的活性成分筛选较少[8]。因此，本实验对分离纯化得到的10个香豆素类化合物进行了抗血小板聚集活性筛选，发现化合物4和8对ADP诱导的血小板聚集有显著的抑制作用。
, 百拇医药
1仪器与材料
Bruker-400和Bruker AVIIIHD-600核磁共振波谱仪，Waters Synapt G2高分辨质谱仪。中压液相色谱仪(Búchi Gradient Former B-687， Rp C18，40～60 μm，Welch公司)；薄层色谱硅胶GF254、柱色谱硅胶(200～300目)均为青岛海洋化工厂生产；MCI柱色谱CHP 20P(75～150 μm)为日本Mitsubishi Chemical公司生产；Sephadex LH-20为瑞典Amershan Pharmacia公司生产。所用试剂均为分析纯。
益母草药材于2012年5月采集于四川省成都市温江区，经成都中医药大学李敏教授鉴定为益母草L. japonicus的干燥全草，标本(SYMC-0522)存放于成都中医药大学药学院中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地。
2提取与分离
, 百拇医药
干燥粉碎的益母草20 kg，用95%乙醇回流提取3次，每次2 h。提取液减压浓缩得浸膏1.2 kg，混悬于水中，用乙酸乙酯萃取，回收溶剂得乙酸乙酯提取物(400 g)。乙酸乙酯部分用硅胶柱色谱分离，石油醚-丙酮(100∶1～0∶1)梯度洗脱，洗脱液经薄层色谱检测，合并，浓缩得到19个洗脱部分A～S。G部分经MCI柱色谱梯度洗脱甲醇-水(30%～100%)分成10份(G1～G8)。G1经Sephadex LH-20柱色谱、制备薄层色谱和HPLC半制备色谱等方法分离得到化合物6(8.0 mg)和9(36 mg)。G2经反复硅胶柱色谱、重结晶等得到化合物1(47 mg)。G3经Sephadex LH-20柱色谱以及反复硅胶柱色谱、制备薄层色谱分离得到化合物5(12 mg)和10(21 mg)。H部分经MCI柱色谱梯度洗脱(50%～100%)分成5份(H1～H5)。其中H2部分经Sephadex LH-20柱色谱分离得到3部分(H2-1～H2-3)，经制备薄层色谱法和HPLC半制备色谱法分离纯化得到2(6 mg)，3(8 mg)，4(10 mg)，7(9 mg)，8(19 mg)。
, 百拇医药
3结构鉴定
化合物1无色针状结晶(甲醇)；HR-ESI-MS m/z 217.049 8[M+H]+，239.031 6[M+Na]+，分子式C12H8O4；1H-NMR(CD3COCD3，600 MHz)δ：6.25(1H，d，J=9.6 Hz，H-3)，8.21(1H，d，J=9.6 Hz，H-4)，7.16(1H，s，H-8)，4.34(3H，s，OMe)，7.87(1H，d，J=2.4 Hz，H-2′)，7.32(1H，d，J=2.4，H-3′)； 13C-NMR(CD3COCD3，150 MHz)δ：160.8(C-2)，113.6(C-3)，139.9(C-4)，146.3(C-5)，113.6(C-6)，159.3(C-7)，93.9(C-8)，153.8(C-9)，106.3(C-10)，150.8(C-2′)，107.0(C-3′)，60.8(OMe-5)。以上数据与文献[9]报道的bergapten数据一致。
化合物2白色粉末；HR-ESI-MS m/z 217.049 9[M+H]+，239.032 0[M+Na]+，分子式C12H8O4；1H-NMR(CD3COCD3，600 MHz) δ：6.36(1H，d，J=9.6 Hz，H-3)，7.97(1H，d，J=9.6 Hz，H-4)，7.63(1H，s，H-5)，4.34(3H，s，OMe-8)，7.87(1H，d，J=2.4 Hz，H-2′)，7.03(1H，d，J=2.4，H-3′)。以上数据与文献[10]报道的xanthotoxin数据一致。, 百拇医药(杨槐 周勤梅 彭成 刘露丝 谢晓芳 熊亮 刘昭华)
[关键词]益母草；香豆素类化合物；分离鉴定；抗血小板聚集
益母草Leonurus japonicus是常用的中药材品种，原名茺蔚，别名益母艾、苦草、坤草、月母草、地母草等，传统上以开花前的地上部分入药。益母草在《神农本草经》和《本草纲目》中均被列为上品，其性微寒，味辛苦，具有调经活血、利尿消肿、祛痰生新之功效，为妇科婴药，被称为“血家圣药、经产良药”[1]。临床上主要用于月经不调，痛经经闭，恶露不尽，水肿尿少，疮疡肿毒等症[2]。目前有关益母草化学成分的报道较多，主要为生物碱[3]、二萜[4]、环烯醚萜苷[5]、黄酮[6]、三萜[7]等，但针对益母草传统功效的活性成分筛选较少[8]。因此，本实验对分离纯化得到的10个香豆素类化合物进行了抗血小板聚集活性筛选，发现化合物4和8对ADP诱导的血小板聚集有显著的抑制作用。
, 百拇医药
1仪器与材料
Bruker-400和Bruker AVIIIHD-600核磁共振波谱仪，Waters Synapt G2高分辨质谱仪。中压液相色谱仪(Búchi Gradient Former B-687， Rp C18，40～60 μm，Welch公司)；薄层色谱硅胶GF254、柱色谱硅胶(200～300目)均为青岛海洋化工厂生产；MCI柱色谱CHP 20P(75～150 μm)为日本Mitsubishi Chemical公司生产；Sephadex LH-20为瑞典Amershan Pharmacia公司生产。所用试剂均为分析纯。
益母草药材于2012年5月采集于四川省成都市温江区，经成都中医药大学李敏教授鉴定为益母草L. japonicus的干燥全草，标本(SYMC-0522)存放于成都中医药大学药学院中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地。
2提取与分离
, 百拇医药
干燥粉碎的益母草20 kg，用95%乙醇回流提取3次，每次2 h。提取液减压浓缩得浸膏1.2 kg，混悬于水中，用乙酸乙酯萃取，回收溶剂得乙酸乙酯提取物(400 g)。乙酸乙酯部分用硅胶柱色谱分离，石油醚-丙酮(100∶1～0∶1)梯度洗脱，洗脱液经薄层色谱检测，合并，浓缩得到19个洗脱部分A～S。G部分经MCI柱色谱梯度洗脱甲醇-水(30%～100%)分成10份(G1～G8)。G1经Sephadex LH-20柱色谱、制备薄层色谱和HPLC半制备色谱等方法分离得到化合物6(8.0 mg)和9(36 mg)。G2经反复硅胶柱色谱、重结晶等得到化合物1(47 mg)。G3经Sephadex LH-20柱色谱以及反复硅胶柱色谱、制备薄层色谱分离得到化合物5(12 mg)和10(21 mg)。H部分经MCI柱色谱梯度洗脱(50%～100%)分成5份(H1～H5)。其中H2部分经Sephadex LH-20柱色谱分离得到3部分(H2-1～H2-3)，经制备薄层色谱法和HPLC半制备色谱法分离纯化得到2(6 mg)，3(8 mg)，4(10 mg)，7(9 mg)，8(19 mg)。
, 百拇医药
3结构鉴定
化合物1无色针状结晶(甲醇)；HR-ESI-MS m/z 217.049 8[M+H]+，239.031 6[M+Na]+，分子式C12H8O4；1H-NMR(CD3COCD3，600 MHz)δ：6.25(1H，d，J=9.6 Hz，H-3)，8.21(1H，d，J=9.6 Hz，H-4)，7.16(1H，s，H-8)，4.34(3H，s，OMe)，7.87(1H，d，J=2.4 Hz，H-2′)，7.32(1H，d，J=2.4，H-3′)； 13C-NMR(CD3COCD3，150 MHz)δ：160.8(C-2)，113.6(C-3)，139.9(C-4)，146.3(C-5)，113.6(C-6)，159.3(C-7)，93.9(C-8)，153.8(C-9)，106.3(C-10)，150.8(C-2′)，107.0(C-3′)，60.8(OMe-5)。以上数据与文献[9]报道的bergapten数据一致。
化合物2白色粉末；HR-ESI-MS m/z 217.049 9[M+H]+，239.032 0[M+Na]+，分子式C12H8O4；1H-NMR(CD3COCD3，600 MHz) δ：6.36(1H，d，J=9.6 Hz，H-3)，7.97(1H，d，J=9.6 Hz，H-4)，7.63(1H，s，H-5)，4.34(3H，s，OMe-8)，7.87(1H，d，J=2.4 Hz，H-2′)，7.03(1H，d，J=2.4，H-3′)。以上数据与文献[10]报道的xanthotoxin数据一致。, 百拇医药(杨槐 周勤梅 彭成 刘露丝 谢晓芳 熊亮 刘昭华)