2.6 心肌组织中MF相关调控基因mRNA表达的检测

    取“2.5”项下心肌下部组织适量，采用Trizol一步法提取大鼠心肌组织总RNA，使用紫外-分光光度计测定其纯度。将总RNA反转录为cDNA，使用Primer 5.0软件设计Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、MMP-3、MMP-9、TGF-β1、Smad3、β-actin的PCR引物(其序列见表1)，使用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒、采用实时荧光定量PCR法以实时定量PCR仪进行扩增。反应体系(共50 ?L)：cDNA 1 ?L，上、下游引物对(25 ?mol/L)各0.6 ?L，2×PCR Buffer 25 ?L，20×SYBR green Ⅰ 0.3 ?L，无RNase水22.5 ?L。反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循环35次。以β-actin为内参，生成各目的mRNA的标准曲线、扩增曲线及熔解曲线，采用相对比值法以CFX ManagerTM V2.1软件计算各目的mRNA的相对表达量(即目的mRNA的Ct值与内参mRNA的Ct值的比值，Ct值表示每个反应管内荧光信号强度达到设定阈值时所经历的循环数) ......