重组改构人肿瘤坏死因子(rmhTNF)增强乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性
【摘要】 目的 探讨重组改构人肿瘤坏死因子(rmhTNF)在人乳腺癌细胞株MCF-7细胞中对阿霉素(ADM)的增敏作用和逆转多药耐药性细胞株MCF-7/Adr细胞对ADM的耐药性，并初步探讨rmhTNF与ADM联合使用时的用药顺序，为临床用药提供依据。方法 用CCK-8法测定不同顺序联合使用rmhTNF和ADM后的人乳腺癌细胞MCF-7及其耐药性细胞MCF-7/Adr的细胞存活率(cell survival rate，CSR)。结果 先用ADM处理24h后再更换使用rmhTNF处理24h后，能够提高MCF-7细胞对ADM的敏感性，同样的处理还能逆转多药耐药性MCF-7/Adr细胞对ADM的耐药性;联合使用ADM及rmhTNF时，能显著提高MCF-7细胞对ADM的敏感性，但MCF-7/Adr细胞对ADM没有明显增敏作用。结论 rmhTNF与ADM联合使用时，能够提高MCF-7细胞对ADM的敏感性，并可逆转MCF-7/Adr细胞对ADM的耐药性。
关键词 重组改构人肿瘤坏死因子 阿霉素 人乳腺癌
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细胞 CCK-8法 【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)11-0961-04
Enhancing the sensitivity of human breast cancer cells to adriamicin by the
treatment of recombinant mutant human tumor necrosis factor-alpha(rmhTNF)
Zhao Guoguang，Lu Yanjun，Tang Juanjuan，et al.
Department of Chemotherapy，Shanghai Oncology Hospital，Fudan University，Shanghai200030.
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective To investigate the role of an alternative treatment of recombinant mutant human tumor necrosis factor-alpha(rmhTNF)and adriamicin(ADM)in enhancing sensitivity to ADM in human breast cancer cell line MCF-7and restoring sensitivity to ADM in its multidrug-resistant cell line MCF-7/Adr.Methods After the treatment of rmhTNF in combination with ADM，the cell survival rates of MCF-7cells and MCF-7/Adr cells were detected through the method of CCK-8colorimetric analysis.Results The sensitivity to ADM increased in MCF-7cells after the treatment of ADM for24hours followed by rmhTNF for another24hours，comparing to the treatment of ADM alone for48hours.Furthermore，the same treatment restored the sensitivity to ADM in the multidrug-resistant cell line MCF-7Adr.The sensitivity to ADMwas enhanced significantly by the combination of rmhTNF and ADM adˉministrated simultaneously，comparing to the treatment of ADM alone for48hours.However，the sensitivity to ADMwas not enhanced in MCF-7/Adr cells when rmhTNFand ADMwere administrated simultaneously.Conclusion In comˉbination with ADM，rmhTNF can enhance the sensitivity to ADM in MCF-7cells，and restore the sensitivity to ADM in MCF-7/Adr cells.
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Key words recombinant mutant human tumor necrosis factor(rmhTNF) adriamicin(ADM) human breast cancer cell CCK-8assay
乳腺癌是目前危害妇女生命最常见的肿瘤，化疗是目前临床上治疗乳腺癌的主要手段之一。但是，在临床上肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药性(multidrug resistance，MDR)往往导致化疗失败。MDR是指肿瘤细胞能对多种化学结构、功能和作用机制均不同的抗癌药物产生交叉抗药性。易引起典型MDR的药物一般是天然来源和疏水性药物，如阿霉素(adriamycin，ADM)和长春花生物碱，也包括一些合成药物，如米托蒽醌。ADM是临床上广泛使用的一种抗肿瘤化疗药物，是乳腺癌化疗的一线药物，为蒽环类抗生素，可以嵌入DNA的两个相邻碱基对，与其双螺旋结构形成复合物，抑制与DNA复制及转录聚合酶和DNA依赖性的RNA聚合酶，影响DNA和RNA的合成，因此ADM对S期细胞最敏感，M期细胞次之。
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研究结果表明，克服肿瘤耐药性的主要途径有:(1)应用MDR调节剂，逆转多药耐药性;(2)提高药物剂量强度，如大剂量化疗;(3)应用解救化疗方案，换用其他无交叉耐药性的药物。体外实验中，业已证实能逆转多药耐药性的药物包括:钙通道阻断剂(如异搏定)、调钙素抑制剂(如酚噻嗪)、免疫调节剂(如环孢素-A)、奎尼丁类及细胞因子(如肿瘤坏死因子)等 [1，2] 。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)是一种具有多种生物学功能的细胞因子，是迄今为止所发现的杀伤力最强的抗肿瘤细胞因子，可以特异性地引起肿瘤细胞坏死，并可逆转肿瘤细胞的MDR，增加化疗敏感性 [3] ，近年来有报道，肿瘤坏死因子可以在基因、蛋白及细胞水平上逆转肿瘤细胞的耐药性，增加产生多药耐药性的药物对癌细胞的毒性，克服多药耐药表型 [4] 。但是全身大剂量应用人TNF-α可产生严重的毒副作用，而小剂量又难以达到治疗效果，限制了其在临床上的应用。因此，国内外许多学者通过改变TNF-α的结构寻找高效、低毒的TNF突变体，并取得较大进展。2003年4月中国SFDA批准上市的国家一类新药—重组改构人肿瘤坏死因子(recombinant mutant human tumor necrosis factorpalpha，rmhTNF)即是应用蛋白质工程技术改造天然TNF-α而制成的高活性、低毒性的基因工程TNF-α。最近有研究发现rmhTNF能够有效提高对ADM不敏感的人大肠癌肿瘤细胞对ADM的敏感性。本研究旨在探讨体外rmhTNF在人乳腺癌细胞中与ADM联合使用时的协同作用，和逆转多药耐药性人乳腺癌细胞对ADM的耐药性，并初步探讨二者联合使用时的用药顺序，为临床用药提供依据。
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1 材料与方法
1.1 细胞株与细胞培养 MCF-7细胞株及MCF-7/Adr细胞株均为人乳腺癌细胞株，前者来源于乳腺癌患者的胸腔积液(白人成年女性)，后者是前者接触浓度递增的阿霉素诱导而成的耐药株，同时对多种化疗药物具有交叉耐药性，即具有多药耐药性(MDR)。以上两株细胞来源于复旦大学附属肿瘤医院中心实验室。在5%CO 2 、37℃环境中培养，细胞培养液为DMEM，并加入了10%的小牛血清。
1.2 实验材料及主要试剂 重组改构人肿瘤坏死因子(rmhTNF)由上海赛达生物药业有限公司提供，比活性为2.5×10 5 U/μl。阿霉素(ADM)购于浙江海正药业公司。DMEM及小牛血清为美国Hyclone公司产品。酶联免疫测定仪为澳大利亚BIO-TEK公司产品。CCK-8为日本同仁化学研究所Dojindo Laboratories产品，该试剂中含有WST-8即2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪嗡硫酸二甲酯的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲 月赞染料，生成的甲 月赞 物的数量与活细胞的数量成正比。
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1.3 细胞毒性分析 取对数生长期乳腺癌细胞，常规消化成2×10 4 /ml的单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，每孔100μl DMEM细胞培养液。5%CO 2 、37℃环境中培养24h后分别加入5组药物:第1组加入不同浓度ADM，培养48h;第2组加入不同浓度rmhTNF，培养48h;第3组加入不同浓度ADM，培养24h后去除含有ADM的培养液，再加入一定浓度rmhTNF(500U/ml)，培养24h;第4组加入一定浓度ADM(2μg/ml)或泰素(taxol，浓度为20nM)，培养24h后去除含有ADM或taxol的培养液，再加入不同浓度rmhTNF，培养24h;第5组同时加入不同浓度rmhTNF及一定浓度ADM(2μg/ml)，培养48h。检测时，每孔细胞中加入5μl的CCK-8试剂，5%CO 2、37℃环境中培养2h后，在酶标仪上波长450nm处读取光密度A值，计算细胞存活率(cell survival rate，CSR)。
细胞存活率(CSR)=试验组A值对照组A值×100%
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1.4 统计学方法 所有数据均以均数表示，采用t检验。
2 结果
2.1 MCF-7/Adr对ADM处理不敏感 MCF-7/Adr细胞 是一株源于人乳腺癌细胞株MCF-7细胞的多药耐药性的乳腺癌细胞，研究证明它对包括ADM在内的多种化疗药物不敏感。在本研究中我们用各种不同浓度的ADM(1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml，6μg/ml及8μg/ml)分别处理MCF-7细胞和MCF-7/Adr细胞，48h后用CCK-8法测定细胞的存活率，其结果如图1所示:耐药性MCF-7/Adr细胞对所有浓度的ADM处理均无反应，细胞存活率维持在100%左右，而亲代株MCF-7细胞的存活率却随着ADM浓度的增加明显下降，当ADM浓度为8μg/ml时，其细胞存活率不足50%。这个结果确认了ADM对亲代MCF-7细胞的毒性作用和多药耐药性株MCF-7/Adr细胞对ADM的不敏感性。
2.2 rmhTNF逆转MCF-7/Adr细胞对ADM的耐药性 在临床上对化疗药物产生耐药性是目前肿瘤治疗中的一大难题。在这个研究中，我们对耐药性株MCF-7/Adr细胞在第一天用ADM(6μg/ml)处理后，在第二天用新近上市的国家一类新药重组改构人肿瘤坏死因子(rmhTNF)(500U/ml)处理，结果如图2a所示。发现耐药株MCF-7/Adr细胞从原本2天单用ADM(6μg/ml)的91.80%细胞存活率，下降至67.37%细胞存活率，其敏感性上升了24.43%，而且其药物处理后的敏感性同其亲代敏感株MCF-7细胞对ADM的敏感性(细胞存活率为67.79%)相差无几(图2a)。这个结果证明了ADM处理后再用rmhTNF，能逆转多药耐药株MCF-7/Adr细胞对化疗药物ADM的不敏感性。
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而且我们还在第一天先用不同浓度的ADM(1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml，6μg/ml及8μg/ml)处理后，第二天再换成rmhTNF(500U/ml)处理，发现MCF-7/Adr细胞的存活率同2天单用ADM相比，呈现一个下降的变化(图2b)，分别下降至70.4%，72.16%，66.26%，67.37%和73.34%，差异有非常显著性(P<0.01)。由此可以认为ADM处理后更换使用rmhTNF，有可能逆转耐药株MCF-7/Adr细胞对ADM的耐药性。为了确定低浓度的rmhTNF对逆转耐药性的影响，我们又用浓度为2μg/ml的ADM第一天处理后，第二天再更换成不同浓度的rmhTNF(0～400U/ml)处理，结果发现MCF-7/Adr细胞的存活率同2天单用ADM(2μg/ml)相比，也出现明显下降(P<0.01)(图3a)，尤其当rmhTNF的浓度为1U/ml时下降最明显(90.00%vs74.29%)，说明低浓度rmhTNF也能够逆转MCF-7/Adr细胞对ADM的耐药性。
鉴于MCF-7/Adr细胞是多药耐药性细胞，它不仅对ADM有耐受性，对其他多种化疗药物也有明显的耐受性，因此我们把化疗药物ADM更换成泰素(taxol，浓度为20nM)，同样处理，结果如图3b所示:低浓度rmhTNF也能够逆转MCF-7/Adr细胞对taxol的不敏感性(P<0.01)，而且当rmhTNF的浓度为1U/ml时下降最明显(90.00%vs68.40%)。
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在此基础上，我们单用rmhTNF处理McF-7细胞和McF细胞，其结果如图4所示，我们看到单用rmhTNF(0～500U/ml)2天后，无论是亲代株MCF-7细胞还是耐药株MCF-7/Adr细胞，存活率均在100%左右(P>0.05)，都没有显示明显的细胞毒性。这个结果提示单用rmhTNF(500U/ml以内)没有明显的细胞毒性，但是rmhTNF同化疗药物ADM的联合更换使用却能明显提高对耐药株MCF-7/Adr肿瘤细胞毒性作用。
2.3 rmhTNF提高MCF-7细胞对ADM的敏感性 众所周知，ADM是细胞周期依赖性药物，而rmhTNF是一种细胞因子，不依赖于细胞周期。在这个研究中，我们第一次发现了这二种不同类型的药物的更换使用能够逆转乳腺癌耐药株MCF-7/Adr细胞对药物的不敏感性。因此，我们用同样的方法处理其亲代株MCF-7细胞，即第一天用各种不同浓度的ADM(1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml，6μg/ml及8μg/ml)处理，第二天更换成rmhTNF(500U/ml)处理，测定其CSR，其结果如图5所示:同MCF-7/Adr细胞一样，与2天单用ADM处理相比，在ADM处理后的第二天更换成rmhTNF处理，能明显提高对MCF-7细胞的毒性作用(P<0.01)，其CSR分别由2天单用ADM的97.10%，85.59%，69.25%，67.79%和49.55%，下降至ADM处理后更换成rmhTNF的89.44%，53.15%，39.17%，48.47%和31.65%，分别下降了7.66%，32.44%，30.08%，19.32%和17.9%。这个结果进一步证实了ADM处理后更换成rmhTNF处理能明显提高肿瘤细胞MCF-7对化疗药物ADM的敏感性。
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2.4 同时联合使用ADM和rmhTNF对MCF-7细胞和MCF-7/Adr细胞的敏感性的影响 我们进一步探讨同时联合使用ADM和rmhTNF对乳腺癌MCF-7细胞和其耐药株MCF-7/Adr细胞毒性的影响。我们同时用各种不同浓度的rmhTNF(0～500U/ml)和固定浓度的ADM(2μg/ml)联合处理MCF-7细胞和MCF-7/Adr细胞2天后测定其CSR，结果如图6a、b所示:在MCF-7细胞中，ADM(2μg/ml)同时联合使用不同浓度的rmhTNF(0～500U/ml)48h，同单用ADM(2μg/ml)48h相比(其存活率为85.59%)，其CSR明显下降(P<0.01)，最大下降至22.36%(rmhTNF浓度为300U/ml时)，最小下降至52.90%(rmhTNF浓度为1U/ml时);然而对于耐药株MCF-7/Adr细胞，ADM(2μg/ml)联合使用不同浓度的rmhTNF(0～500/ml)48h，其CSR维持在100%左右，细胞毒性作用没有明显地提高(P>0.05)。这个结果证明了ADM同时联合使用rmhTNF，可以提高MCF-7细胞对ADM的敏感性，而对MCF-7/Adr细胞没有作用。
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3 讨论
在这个研究中我们通过体外细胞毒性分析法证实:ADM处理后更换使用rmhTNF能够提高亲代人乳腺癌MCF-7细胞对化疗药物ADM的敏感性和逆转其耐药株MCF-7/Adr细胞对ADM的耐药性;同时联合使用ADM和rmhTNF，可以显著提高MCF-7细胞对ADM的敏感性，而对MCF-7/Adr细胞没有作用。众所周知，肿瘤是克隆性生长的，即使化疗药物杀灭几乎所有的敏感性肿瘤细胞后，只要留下单个耐药性细胞，这个细胞就会在条件合适时克隆性生长成新的肿瘤，而这个新的耐药细胞系已经在基因表达上发生了根本性的改变。本研究所用的亲代乳腺癌细胞株MCF-7细胞和其多药耐药株MCF-7/Adr细胞即为一个例子。亲代的MCF-7细胞带有野生型P53基因，而其发生多药耐药性的MCF-7/Adr细胞则带有过量表达的突变型P53基因。与MCF-7细胞中野生型P53基因相比，MCF-7/Adr细胞中的突变型P53基因在外显子5中缺失了codon为126～133的密码子，从而导致其稳定性增加、过度表达并定位于细胞核(MCF-7细胞中野生型P53定位于细胞质) [5] 。另外，临床上亦发现部分原为野生型P53基因的乳腺癌患者，在发生耐药时其P53基因亦发生了突变。 有研究发现变异型P53蛋白表达量与人乳腺癌细胞对ADM的抗药指数呈正相关，证实P53突变与肿瘤抗药性表型及临床化疗效果有关 [6] 。
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P53基因是定位于人的17号染色体17p13.1(鼠位于11号染色体)的一个单拷贝抑癌基因，DNA长度为16～20kb，由11个外显子和10个内含子组成 [7] 。P53基因的功能主要为:当各种理化因素造成细胞DNA损伤时，P53可启动WAF/CIPI基因的表达编码出一种叫P21的蛋白质，P21能抑制cdk2酶的活性，使细胞停滞在G 1 期，不能进行分裂，以使损伤的基因有一个修复的过程 [8，9] ;若修复无效，P53基因可介导DNA损伤的细胞进行程序性死亡，即细胞凋亡，以达到抑癌目的 [10] 。P53基因的功能可因其等位基因的缺失、在细胞质中的沉没及点突变等原因而缺失。P53基因功能缺失不仅可导致人类肿瘤的发生(人类50%以上的肿瘤发生与P53基因功能缺失有关)，还可导致肿瘤细胞对化疗药物(如ADM)产生耐药性。多数肿瘤在P53基因功能缺失时化疗效果差，如造血系统恶性肿瘤 [11] 、Wilm′s瘤 [12] 、胃癌 [13] 、Burkitt′s淋巴瘤 [14] 等。P53基因突变时还可引起大肠癌多药耐药 [15] 。P53基因功能缺失导致肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性的机理可能为:突变的P53蛋白可激活MDR1基因产物P-糖蛋白(glycoprotein，P-gp)，使之过度活化，使进入细胞的药物被不断泵出，从而参与了多药耐药性的发生 [16] 。
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本文研究结果发现，MCF-7/Adr细胞对单用ADM处理极度不敏感(图1)，而在第一天用ADM(6μg/ml)处理的基础上第二天再换用rmhTNF(500U/ml)处理，可以明显地提高多药耐药性MCF-7/Adr细胞对ADM的敏感性(图2a:91.80%VS67.37%)。从图2b中也可以看到第一天不同浓度ADM处理后第二天再换用rmhTNF(500U/ml)处理，也可以逆转多药耐药株MCF-7/Adr细胞对ADM的耐药性。我们还发现第一天用浓度为2μg/ml的ADM处理后，第二天再换用不同浓度的rmhTNF(0～400U/ml)处理，低浓度rmhTNF也能够逆转MCF-7/Adr细胞对ADM的耐药性，尤其当rmhTNF的浓度较低仅为1U/ml时作用最明显(90.00%VS74.29%)(图3a);把化疗药物ADM更换成taxol(20nM)，也得出相同的结果(图3b);这些结果明确的证明了rmhTNF能够逆转多药耐药性MCF-7/Adr细胞的耐药性。不仅如此，这种更替用药的处理方法还可以增强其亲代株MCF-7细胞对ADM的敏感性(图5)。而ADM同时联合使用rmhTNF则能够对MCF-7细胞产生更为明显的增敏作用(图6a)。由此，我们认为rmhTNF在抗肿瘤中的作用是明确的，它不仅能够增强乳腺癌细胞MCF-7细胞对化疗药物ADM的敏感性，还能逆转其多药耐药株MCF-7/Adr细胞对ADM的耐药性。综合其他研究 [17] 我们认为可能的机理是:同大部分化疗药物一样，本研究中所采用的ADM主要是损伤细胞的DNA，处于细胞周期中的肿瘤细胞，即在DNA复制期(S)和(或)有丝分裂期(M)中的肿瘤细胞，因为DNA的损伤而导致DNA复制和分裂的混乱，最后导致细胞不堪忍受这种巨大的DNA的损伤重负，而趋向凋亡。而细胞间隙期(G1或G2)的细胞，因为不进行DNA复制和分裂，可以通过保留DNA的损伤而逃避凋亡。如果带有野生型P53基因，这些间歇期的肿瘤细胞可以通过依赖于P53的凋亡途径，如box/bcl2等而引发凋亡;如果P53基因功能缺失，这些间歇期的肿瘤细胞由于不能发生细胞凋亡而逃避了死亡，从而对化疗药物产生耐药性。而rmhTNF是不依赖细胞周期的药物，它可以通过活化NFκB/RelA干扰P21功能，增强cdk2酶的活性，使因P53基因功能缺失而逃避了死亡的间歇期的肿瘤细胞重新进入细胞周期运行;但因为这些细胞的DNA已受到损伤，当这些细胞进入DNA复制期和(或)有丝分裂期时，由于DNA的损伤导致DNA复制和分裂混乱，从而死亡 [5] 。也有人认为可能是因为ADM是拓扑异构酶Ⅱ抑制剂，而TNF-α可增加拓扑异构酶Ⅱ抑制剂所致DNA复制过程中酶-DNA复合体的稳定性和数量的积累，使DNA再螺旋受阻，由此加剧DNA损害而致细胞死亡 [18] 。
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综上所述，本研究发现rmhTNF能够增强乳腺癌细胞MCF-7细胞对化疗药物ADM的敏感性，并能逆转其多药耐药株MCF-7/Adr细胞对ADM的耐药性。国内外有些报道rmhTNF和化疗药物联合使用可以对肿瘤细胞有增敏作用，但是本研究在用药方法和顺序上作了改进，这也为临床上的运用提供了良好的实验室机理的依据。(本文图片略)
参考文献
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作者单位:1 200030复旦大学上海肿瘤医院化疗科
2 201203上海赛达生物药业有限公司
(编辑 李木), 百拇医药
关键词 重组改构人肿瘤坏死因子 阿霉素 人乳腺癌
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Zhao Guoguang，Lu Yanjun，Tang Juanjuan，et al.
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【Abstract】 Objective To investigate the role of an alternative treatment of recombinant mutant human tumor necrosis factor-alpha(rmhTNF)and adriamicin(ADM)in enhancing sensitivity to ADM in human breast cancer cell line MCF-7and restoring sensitivity to ADM in its multidrug-resistant cell line MCF-7/Adr.Methods After the treatment of rmhTNF in combination with ADM，the cell survival rates of MCF-7cells and MCF-7/Adr cells were detected through the method of CCK-8colorimetric analysis.Results The sensitivity to ADM increased in MCF-7cells after the treatment of ADM for24hours followed by rmhTNF for another24hours，comparing to the treatment of ADM alone for48hours.Furthermore，the same treatment restored the sensitivity to ADM in the multidrug-resistant cell line MCF-7Adr.The sensitivity to ADMwas enhanced significantly by the combination of rmhTNF and ADM adˉministrated simultaneously，comparing to the treatment of ADM alone for48hours.However，the sensitivity to ADMwas not enhanced in MCF-7/Adr cells when rmhTNFand ADMwere administrated simultaneously.Conclusion In comˉbination with ADM，rmhTNF can enhance the sensitivity to ADM in MCF-7cells，and restore the sensitivity to ADM in MCF-7/Adr cells.
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乳腺癌是目前危害妇女生命最常见的肿瘤，化疗是目前临床上治疗乳腺癌的主要手段之一。但是，在临床上肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药性(multidrug resistance，MDR)往往导致化疗失败。MDR是指肿瘤细胞能对多种化学结构、功能和作用机制均不同的抗癌药物产生交叉抗药性。易引起典型MDR的药物一般是天然来源和疏水性药物，如阿霉素(adriamycin，ADM)和长春花生物碱，也包括一些合成药物，如米托蒽醌。ADM是临床上广泛使用的一种抗肿瘤化疗药物，是乳腺癌化疗的一线药物，为蒽环类抗生素，可以嵌入DNA的两个相邻碱基对，与其双螺旋结构形成复合物，抑制与DNA复制及转录聚合酶和DNA依赖性的RNA聚合酶，影响DNA和RNA的合成，因此ADM对S期细胞最敏感，M期细胞次之。
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研究结果表明，克服肿瘤耐药性的主要途径有:(1)应用MDR调节剂，逆转多药耐药性;(2)提高药物剂量强度，如大剂量化疗;(3)应用解救化疗方案，换用其他无交叉耐药性的药物。体外实验中，业已证实能逆转多药耐药性的药物包括:钙通道阻断剂(如异搏定)、调钙素抑制剂(如酚噻嗪)、免疫调节剂(如环孢素-A)、奎尼丁类及细胞因子(如肿瘤坏死因子)等 [1，2] 。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)是一种具有多种生物学功能的细胞因子，是迄今为止所发现的杀伤力最强的抗肿瘤细胞因子，可以特异性地引起肿瘤细胞坏死，并可逆转肿瘤细胞的MDR，增加化疗敏感性 [3] ，近年来有报道，肿瘤坏死因子可以在基因、蛋白及细胞水平上逆转肿瘤细胞的耐药性，增加产生多药耐药性的药物对癌细胞的毒性，克服多药耐药表型 [4] 。但是全身大剂量应用人TNF-α可产生严重的毒副作用，而小剂量又难以达到治疗效果，限制了其在临床上的应用。因此，国内外许多学者通过改变TNF-α的结构寻找高效、低毒的TNF突变体，并取得较大进展。2003年4月中国SFDA批准上市的国家一类新药—重组改构人肿瘤坏死因子(recombinant mutant human tumor necrosis factorpalpha，rmhTNF)即是应用蛋白质工程技术改造天然TNF-α而制成的高活性、低毒性的基因工程TNF-α。最近有研究发现rmhTNF能够有效提高对ADM不敏感的人大肠癌肿瘤细胞对ADM的敏感性。本研究旨在探讨体外rmhTNF在人乳腺癌细胞中与ADM联合使用时的协同作用，和逆转多药耐药性人乳腺癌细胞对ADM的耐药性，并初步探讨二者联合使用时的用药顺序，为临床用药提供依据。
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1 材料与方法
1.1 细胞株与细胞培养 MCF-7细胞株及MCF-7/Adr细胞株均为人乳腺癌细胞株，前者来源于乳腺癌患者的胸腔积液(白人成年女性)，后者是前者接触浓度递增的阿霉素诱导而成的耐药株，同时对多种化疗药物具有交叉耐药性，即具有多药耐药性(MDR)。以上两株细胞来源于复旦大学附属肿瘤医院中心实验室。在5%CO 2 、37℃环境中培养，细胞培养液为DMEM，并加入了10%的小牛血清。
1.2 实验材料及主要试剂 重组改构人肿瘤坏死因子(rmhTNF)由上海赛达生物药业有限公司提供，比活性为2.5×10 5 U/μl。阿霉素(ADM)购于浙江海正药业公司。DMEM及小牛血清为美国Hyclone公司产品。酶联免疫测定仪为澳大利亚BIO-TEK公司产品。CCK-8为日本同仁化学研究所Dojindo Laboratories产品，该试剂中含有WST-8即2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪嗡硫酸二甲酯的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲 月赞染料，生成的甲 月赞 物的数量与活细胞的数量成正比。
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1.3 细胞毒性分析 取对数生长期乳腺癌细胞，常规消化成2×10 4 /ml的单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，每孔100μl DMEM细胞培养液。5%CO 2 、37℃环境中培养24h后分别加入5组药物:第1组加入不同浓度ADM，培养48h;第2组加入不同浓度rmhTNF，培养48h;第3组加入不同浓度ADM，培养24h后去除含有ADM的培养液，再加入一定浓度rmhTNF(500U/ml)，培养24h;第4组加入一定浓度ADM(2μg/ml)或泰素(taxol，浓度为20nM)，培养24h后去除含有ADM或taxol的培养液，再加入不同浓度rmhTNF，培养24h;第5组同时加入不同浓度rmhTNF及一定浓度ADM(2μg/ml)，培养48h。检测时，每孔细胞中加入5μl的CCK-8试剂，5%CO 2、37℃环境中培养2h后，在酶标仪上波长450nm处读取光密度A值，计算细胞存活率(cell survival rate，CSR)。
细胞存活率(CSR)=试验组A值对照组A值×100%
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1.4 统计学方法 所有数据均以均数表示，采用t检验。
2 结果
2.1 MCF-7/Adr对ADM处理不敏感 MCF-7/Adr细胞 是一株源于人乳腺癌细胞株MCF-7细胞的多药耐药性的乳腺癌细胞，研究证明它对包括ADM在内的多种化疗药物不敏感。在本研究中我们用各种不同浓度的ADM(1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml，6μg/ml及8μg/ml)分别处理MCF-7细胞和MCF-7/Adr细胞，48h后用CCK-8法测定细胞的存活率，其结果如图1所示:耐药性MCF-7/Adr细胞对所有浓度的ADM处理均无反应，细胞存活率维持在100%左右，而亲代株MCF-7细胞的存活率却随着ADM浓度的增加明显下降，当ADM浓度为8μg/ml时，其细胞存活率不足50%。这个结果确认了ADM对亲代MCF-7细胞的毒性作用和多药耐药性株MCF-7/Adr细胞对ADM的不敏感性。
2.2 rmhTNF逆转MCF-7/Adr细胞对ADM的耐药性 在临床上对化疗药物产生耐药性是目前肿瘤治疗中的一大难题。在这个研究中，我们对耐药性株MCF-7/Adr细胞在第一天用ADM(6μg/ml)处理后，在第二天用新近上市的国家一类新药重组改构人肿瘤坏死因子(rmhTNF)(500U/ml)处理，结果如图2a所示。发现耐药株MCF-7/Adr细胞从原本2天单用ADM(6μg/ml)的91.80%细胞存活率，下降至67.37%细胞存活率，其敏感性上升了24.43%，而且其药物处理后的敏感性同其亲代敏感株MCF-7细胞对ADM的敏感性(细胞存活率为67.79%)相差无几(图2a)。这个结果证明了ADM处理后再用rmhTNF，能逆转多药耐药株MCF-7/Adr细胞对化疗药物ADM的不敏感性。
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而且我们还在第一天先用不同浓度的ADM(1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml，6μg/ml及8μg/ml)处理后，第二天再换成rmhTNF(500U/ml)处理，发现MCF-7/Adr细胞的存活率同2天单用ADM相比，呈现一个下降的变化(图2b)，分别下降至70.4%，72.16%，66.26%，67.37%和73.34%，差异有非常显著性(P<0.01)。由此可以认为ADM处理后更换使用rmhTNF，有可能逆转耐药株MCF-7/Adr细胞对ADM的耐药性。为了确定低浓度的rmhTNF对逆转耐药性的影响，我们又用浓度为2μg/ml的ADM第一天处理后，第二天再更换成不同浓度的rmhTNF(0～400U/ml)处理，结果发现MCF-7/Adr细胞的存活率同2天单用ADM(2μg/ml)相比，也出现明显下降(P<0.01)(图3a)，尤其当rmhTNF的浓度为1U/ml时下降最明显(90.00%vs74.29%)，说明低浓度rmhTNF也能够逆转MCF-7/Adr细胞对ADM的耐药性。
鉴于MCF-7/Adr细胞是多药耐药性细胞，它不仅对ADM有耐受性，对其他多种化疗药物也有明显的耐受性，因此我们把化疗药物ADM更换成泰素(taxol，浓度为20nM)，同样处理，结果如图3b所示:低浓度rmhTNF也能够逆转MCF-7/Adr细胞对taxol的不敏感性(P<0.01)，而且当rmhTNF的浓度为1U/ml时下降最明显(90.00%vs68.40%)。
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在此基础上，我们单用rmhTNF处理McF-7细胞和McF细胞，其结果如图4所示，我们看到单用rmhTNF(0～500U/ml)2天后，无论是亲代株MCF-7细胞还是耐药株MCF-7/Adr细胞，存活率均在100%左右(P>0.05)，都没有显示明显的细胞毒性。这个结果提示单用rmhTNF(500U/ml以内)没有明显的细胞毒性，但是rmhTNF同化疗药物ADM的联合更换使用却能明显提高对耐药株MCF-7/Adr肿瘤细胞毒性作用。
2.3 rmhTNF提高MCF-7细胞对ADM的敏感性 众所周知，ADM是细胞周期依赖性药物，而rmhTNF是一种细胞因子，不依赖于细胞周期。在这个研究中，我们第一次发现了这二种不同类型的药物的更换使用能够逆转乳腺癌耐药株MCF-7/Adr细胞对药物的不敏感性。因此，我们用同样的方法处理其亲代株MCF-7细胞，即第一天用各种不同浓度的ADM(1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml，6μg/ml及8μg/ml)处理，第二天更换成rmhTNF(500U/ml)处理，测定其CSR，其结果如图5所示:同MCF-7/Adr细胞一样，与2天单用ADM处理相比，在ADM处理后的第二天更换成rmhTNF处理，能明显提高对MCF-7细胞的毒性作用(P<0.01)，其CSR分别由2天单用ADM的97.10%，85.59%，69.25%，67.79%和49.55%，下降至ADM处理后更换成rmhTNF的89.44%，53.15%，39.17%，48.47%和31.65%，分别下降了7.66%，32.44%，30.08%，19.32%和17.9%。这个结果进一步证实了ADM处理后更换成rmhTNF处理能明显提高肿瘤细胞MCF-7对化疗药物ADM的敏感性。
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2.4 同时联合使用ADM和rmhTNF对MCF-7细胞和MCF-7/Adr细胞的敏感性的影响 我们进一步探讨同时联合使用ADM和rmhTNF对乳腺癌MCF-7细胞和其耐药株MCF-7/Adr细胞毒性的影响。我们同时用各种不同浓度的rmhTNF(0～500U/ml)和固定浓度的ADM(2μg/ml)联合处理MCF-7细胞和MCF-7/Adr细胞2天后测定其CSR，结果如图6a、b所示:在MCF-7细胞中，ADM(2μg/ml)同时联合使用不同浓度的rmhTNF(0～500U/ml)48h，同单用ADM(2μg/ml)48h相比(其存活率为85.59%)，其CSR明显下降(P<0.01)，最大下降至22.36%(rmhTNF浓度为300U/ml时)，最小下降至52.90%(rmhTNF浓度为1U/ml时);然而对于耐药株MCF-7/Adr细胞，ADM(2μg/ml)联合使用不同浓度的rmhTNF(0～500/ml)48h，其CSR维持在100%左右，细胞毒性作用没有明显地提高(P>0.05)。这个结果证明了ADM同时联合使用rmhTNF，可以提高MCF-7细胞对ADM的敏感性，而对MCF-7/Adr细胞没有作用。
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3 讨论
在这个研究中我们通过体外细胞毒性分析法证实:ADM处理后更换使用rmhTNF能够提高亲代人乳腺癌MCF-7细胞对化疗药物ADM的敏感性和逆转其耐药株MCF-7/Adr细胞对ADM的耐药性;同时联合使用ADM和rmhTNF，可以显著提高MCF-7细胞对ADM的敏感性，而对MCF-7/Adr细胞没有作用。众所周知，肿瘤是克隆性生长的，即使化疗药物杀灭几乎所有的敏感性肿瘤细胞后，只要留下单个耐药性细胞，这个细胞就会在条件合适时克隆性生长成新的肿瘤，而这个新的耐药细胞系已经在基因表达上发生了根本性的改变。本研究所用的亲代乳腺癌细胞株MCF-7细胞和其多药耐药株MCF-7/Adr细胞即为一个例子。亲代的MCF-7细胞带有野生型P53基因，而其发生多药耐药性的MCF-7/Adr细胞则带有过量表达的突变型P53基因。与MCF-7细胞中野生型P53基因相比，MCF-7/Adr细胞中的突变型P53基因在外显子5中缺失了codon为126～133的密码子，从而导致其稳定性增加、过度表达并定位于细胞核(MCF-7细胞中野生型P53定位于细胞质) [5] 。另外，临床上亦发现部分原为野生型P53基因的乳腺癌患者，在发生耐药时其P53基因亦发生了突变。 有研究发现变异型P53蛋白表达量与人乳腺癌细胞对ADM的抗药指数呈正相关，证实P53突变与肿瘤抗药性表型及临床化疗效果有关 [6] 。
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P53基因是定位于人的17号染色体17p13.1(鼠位于11号染色体)的一个单拷贝抑癌基因，DNA长度为16～20kb，由11个外显子和10个内含子组成 [7] 。P53基因的功能主要为:当各种理化因素造成细胞DNA损伤时，P53可启动WAF/CIPI基因的表达编码出一种叫P21的蛋白质，P21能抑制cdk2酶的活性，使细胞停滞在G 1 期，不能进行分裂，以使损伤的基因有一个修复的过程 [8，9] ;若修复无效，P53基因可介导DNA损伤的细胞进行程序性死亡，即细胞凋亡，以达到抑癌目的 [10] 。P53基因的功能可因其等位基因的缺失、在细胞质中的沉没及点突变等原因而缺失。P53基因功能缺失不仅可导致人类肿瘤的发生(人类50%以上的肿瘤发生与P53基因功能缺失有关)，还可导致肿瘤细胞对化疗药物(如ADM)产生耐药性。多数肿瘤在P53基因功能缺失时化疗效果差，如造血系统恶性肿瘤 [11] 、Wilm′s瘤 [12] 、胃癌 [13] 、Burkitt′s淋巴瘤 [14] 等。P53基因突变时还可引起大肠癌多药耐药 [15] 。P53基因功能缺失导致肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性的机理可能为:突变的P53蛋白可激活MDR1基因产物P-糖蛋白(glycoprotein，P-gp)，使之过度活化，使进入细胞的药物被不断泵出，从而参与了多药耐药性的发生 [16] 。
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本文研究结果发现，MCF-7/Adr细胞对单用ADM处理极度不敏感(图1)，而在第一天用ADM(6μg/ml)处理的基础上第二天再换用rmhTNF(500U/ml)处理，可以明显地提高多药耐药性MCF-7/Adr细胞对ADM的敏感性(图2a:91.80%VS67.37%)。从图2b中也可以看到第一天不同浓度ADM处理后第二天再换用rmhTNF(500U/ml)处理，也可以逆转多药耐药株MCF-7/Adr细胞对ADM的耐药性。我们还发现第一天用浓度为2μg/ml的ADM处理后，第二天再换用不同浓度的rmhTNF(0～400U/ml)处理，低浓度rmhTNF也能够逆转MCF-7/Adr细胞对ADM的耐药性，尤其当rmhTNF的浓度较低仅为1U/ml时作用最明显(90.00%VS74.29%)(图3a);把化疗药物ADM更换成taxol(20nM)，也得出相同的结果(图3b);这些结果明确的证明了rmhTNF能够逆转多药耐药性MCF-7/Adr细胞的耐药性。不仅如此，这种更替用药的处理方法还可以增强其亲代株MCF-7细胞对ADM的敏感性(图5)。而ADM同时联合使用rmhTNF则能够对MCF-7细胞产生更为明显的增敏作用(图6a)。由此，我们认为rmhTNF在抗肿瘤中的作用是明确的，它不仅能够增强乳腺癌细胞MCF-7细胞对化疗药物ADM的敏感性，还能逆转其多药耐药株MCF-7/Adr细胞对ADM的耐药性。综合其他研究 [17] 我们认为可能的机理是:同大部分化疗药物一样，本研究中所采用的ADM主要是损伤细胞的DNA，处于细胞周期中的肿瘤细胞，即在DNA复制期(S)和(或)有丝分裂期(M)中的肿瘤细胞，因为DNA的损伤而导致DNA复制和分裂的混乱，最后导致细胞不堪忍受这种巨大的DNA的损伤重负，而趋向凋亡。而细胞间隙期(G1或G2)的细胞，因为不进行DNA复制和分裂，可以通过保留DNA的损伤而逃避凋亡。如果带有野生型P53基因，这些间歇期的肿瘤细胞可以通过依赖于P53的凋亡途径，如box/bcl2等而引发凋亡;如果P53基因功能缺失，这些间歇期的肿瘤细胞由于不能发生细胞凋亡而逃避了死亡，从而对化疗药物产生耐药性。而rmhTNF是不依赖细胞周期的药物，它可以通过活化NFκB/RelA干扰P21功能，增强cdk2酶的活性，使因P53基因功能缺失而逃避了死亡的间歇期的肿瘤细胞重新进入细胞周期运行;但因为这些细胞的DNA已受到损伤，当这些细胞进入DNA复制期和(或)有丝分裂期时，由于DNA的损伤导致DNA复制和分裂混乱，从而死亡 [5] 。也有人认为可能是因为ADM是拓扑异构酶Ⅱ抑制剂，而TNF-α可增加拓扑异构酶Ⅱ抑制剂所致DNA复制过程中酶-DNA复合体的稳定性和数量的积累，使DNA再螺旋受阻，由此加剧DNA损害而致细胞死亡 [18] 。
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综上所述，本研究发现rmhTNF能够增强乳腺癌细胞MCF-7细胞对化疗药物ADM的敏感性，并能逆转其多药耐药株MCF-7/Adr细胞对ADM的耐药性。国内外有些报道rmhTNF和化疗药物联合使用可以对肿瘤细胞有增敏作用，但是本研究在用药方法和顺序上作了改进，这也为临床上的运用提供了良好的实验室机理的依据。(本文图片略)
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作者单位:1 200030复旦大学上海肿瘤医院化疗科
2 201203上海赛达生物药业有限公司
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